Purificación y fraccionamiento de ficobiliproteínas de Arthrospira platensis y Corallina officinalis con evaluación de sus actividades biológicas.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14270 (2023) Citar este artículo

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Las ficobiliproteínas (PBP) son una clase de pigmentos solubles en agua con una variedad de funciones biológicas que están presentes en macroalgas rojas y especies de cianobacterias. Las formas crudas de ficocianina (C-PC) del alga verde azul Arthrospira platensis y aloficocianina (APC) de la macroalga roja Corallina officinalis se extrajeron y purificaron mediante métodos de precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño, respectivamente. La C-PC y APC obtenidas de A. platensis y C. officinalis fueron 0,31 mg/mL y 0,08 mg/mL, respectivamente, con masas moleculares de “17,0 KDa y 19,0 KDa” y “15,0 KDa y 17,0 KDa” correspondientes a α y subunidades β, respectivamente. Se utilizó FT-IR para caracterizar las APC y C-PC purificadas con el fin de observar sus estructuras. Se obtuvieron extractos altamente purificados (A620/A280 > 4,0) a partir de restas de PC3 y PC4 en las que se analizaron sus actividades biológicas. Los extractos crudos de APC y C-PC más sus fracciones exhibieron un potente antioxidante en diferentes proporciones mediante el uso de tres técnicas. PC1 mostró altas actividades antiinflamatorias (75,99 y 74,55%) y antiartríticas (78,89 y 76,92%) para C. officinalis y A. platensis, respectivamente, en comparación con los fármacos estándar (72,02 y 71,5%). Los extractos metanólicos y acuosos de ambas especies mostraron mayor eficacia antibacteriana contra bacterias marinas Gram +ve que Gram −ve. Nuestro estudio arrojó luz sobre los posibles usos médicos de C-PC y APC extraídos de las especies analizadas como sustancias naturales en una variedad de alimentos y medicamentos. Se requieren más investigaciones para explorar las diversas naturalezas químicas de las distintas PBP de diferentes cianobacterias y algas rojas porque sus secuencias de aminoácidos varían entre las diferentes especies de algas.

Las especies de cianofitos, criptofitos, cianelles y rodófitos tienen ficobilisomas (PBS) que actúan como antenas del aparato de pigmento fotosintético. Los ficobilisomas contienen varias ficobiliproteínas (PBP), que son una categoría de pigmentos proteicos accesorios que permiten a estas especies de algas recolectar energía luminosa fuera de las longitudes de onda absorbidas por la clorofila y los carotenoides, y son responsables de aproximadamente el 50% de la captura de luz de las cianobacterias y las algas rojas1. Estas proteínas solubles en agua de gran color contribuyen entre el 30% y el 50% de la capacidad total de captación de luz de estas biotas al absorber luz en el rango visible de 450 a 650 nm, donde la clorofila se absorbe mal en este rango. Luego transfieren la energía a los complejos de proteína clorofila del fotosistema 2 en las laminillas fotosintéticas2.

Hay más de diez PBP diferentes conocidas, que se pueden clasificar en cuatro grupos según la longitud de onda y la presencia de diferentes cromóforos: las ficoeritrinas (PE) tienen un pico entre 545 y 566 nm; ficoeritrocianinas a 480–580 nm; ficocianinas (PC) a 569–645 nm; y aloficocianinas (APC) a 540–671 nm3. La abundancia de PBP es muy alta (aproximadamente entre el 40% y el 60% del contenido proteico total y el 20% del peso seco de las cianobacterias)4. Las PBP (PE, PC y APC) varían según su posición taxonómica y las condiciones de cultivo2. Las ficobiliproteínas están formadas por subunidades polipeptídicas α y β diferentes5. Las especies de cianobacterias y algas rojas son las principales algas utilizadas para la producción comercial de ficobiliproteínas, que se utilizan como colorantes, etiquetas fluorescentes y herramientas de diagnóstico6. El método de extracción de ficobiliproteínas incluye la ruptura celular para liberar las proteínas del interior de la célula de las algas al exterior. Mientras que las paredes celulares de las cianobacterias son increíblemente resistentes, las de las criptofitas son muy susceptibles a sufrir alteraciones7. En particular, la extracción de ficocianina es un desafío debido a las gruesas paredes celulares y los altos niveles de contaminantes8. Debido a sus propiedades antioxidantes, antitumorales y fotosensibilizantes, así como a su utilidad como marcadores fluorescentes, las PBP han atraído recientemente mucho interés en los campos biotecnológicos de la alimentación y la medicina3,9. La industria farmacéutica está más interesada en la investigación de PBP para aplicaciones medicinales. Según el informe de Future Market Insights, el mercado de PBP tuvo un valor de 112,3 millones de dólares en 2018 y se prevé que su valor se duplique para 202810. Tanto el C-PC como el APC han sido descritos como fuertes agentes antioxidantes contra los radicales libres, podrían ser relacionados con sus fracciones proteicas que son cruciales para el proceso de eliminación de radicales libres11. Especialmente, la C-PC se ha utilizado como proteína natural en la investigación biomédica y alimentaria debido a sus actividades hepatoprotectoras, antioxidantes, eliminadoras de radicales libres, antiinflamatorias, antiartríticas, antitumorales y etiquetado fluorescente en la investigación biomédica12. Comercialmente, la C-PC se produce utilizando cepas de cianobacterias como A. platensis13. Según varios estudios, A. platensis genera PC como pigmento principal además de APC y trazas de PE14. Las aplicaciones económicas de C-PC dependen principalmente de su pureza, que suele estar contaminada con otras proteínas fotosintéticas, en particular APC12. Además, las APC se emplean con frecuencia como sondas de proteínas fluorescentes en procedimientos bioquímicos, especialmente en citometría de flujo15,16. Los APC tienen muchas aplicaciones biotecnológicas, incluidas antioxidantes17 y antivirus18. A pesar de que la APC es una proteína útil, su uso está algo limitado por las dificultades de purificar grandes cantidades de proteína. Debido a la baja concentración de APC en cianobacterias y macroalgas, lo que dificulta su separación y purificación en cantidades considerables, ponemos especial énfasis en purificar APC de C. officinalis. Los objetivos de este estudio fueron identificar las ficobiliproteínas dominantes en dos especies diferentes de algas Corallina officinalis de Rhodophyta (APC) y Arthrospira platensis de Cyanophyta (C-PC). Además de evaluar las actividades antioxidantes, antiinflamatorias, antiartríticas y antibacterianas de cada fracción in vitro.

La purificación de ficobiliproteínas de A. platensis y C. officinalis se optimizó para su máximo nivel de recuperación y pureza, que indican el grado de purificación de cada proteína (Tabla 1). Ambas ficobiliproteínas se purificaron mediante tres pasos de purificación sucesivos, incluida la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de intercambio aniónico utilizando columnas de celulosa DEAE y la cromatografía de exclusión por tamaño utilizando columnas Sephadex G100. Se encontró que el índice de pureza de cada proteína aumentó de 0,87 a 5,64 para C-PC de A. platensis y de 0,49 a 5,51 para APC de C. officinalis (Tabla 1). La precipitación de ficobiliproteínas crudas con 65% de saturación de sulfato de amonio dio como resultado una pureza de 2,56 y 2,23 para los precipitados obtenidos de A. platensis y C. officinalis, respectivamente, con un ligero aumento en el índice de pureza después de la diálisis para ambas ficobiliproteínas (2,91 y 2.38). Durante la purificación cromatográfica, tanto C-PC como APC se separaron eficientemente mediante cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-celulosa) con un gradiente de pH de 3,8 a 5,6 para obtener un pico de elución principal que contenía ficobiliproteínas con una relación de pureza de 3,48 y 2,62 para los purificados. C-PC y APC, respectivamente (Fig. 1). Después del paso de cromatografía de intercambio aniónico, las recuperaciones totales de A. platensis C-PC y C. officinalis APC alcanzaron el 51,28 % y el 56,89 % a partir de los extractos crudos iniciales, lo que equivale a 2,66 y 0,787 mg/mL, respectivamente (Tabla 1). Según los espectros de absorción, las ficobiliproteínas purificadas de A. platensis y C. officinalis mostraron una absorción máxima a 620 nm y 650 nm, respectivamente. Estos resultados indican que los tipos de ficobiliproteínas son de naturaleza C-PC y APC de A. platensis y C. officinalis, respectivamente (Fig. 2A y B). Se descubrió que la purificación tanto de C-PC como de APC mejoraba después de cada paso de purificación (Fig. 2). Desde el extracto crudo hasta las ficobiliproteínas purificadas, la pureza aumentó casi seis veces, lo que demostró la eficiencia del método para obtener C-PC y APC de alta pureza. Además, durante la separación cromatográfica de exclusión por tamaño, tanto las proteínas C-PC como APC mostraron una pureza máxima de 5,64 y 5,51, respectivamente. Las recuperaciones totales de C-PC y APC después de la cromatografía de exclusión por tamaño alcanzaron el 41,8 % y el 40,72 %, lo que equivale a 3,20 y 0,85 mg/ml, respectivamente (Tabla 1). Los resultados de SDS-PAGE de la C-PC purificada de A. platensis revelaron dos bandas de 17,0 KDa y 19,0 KDa correspondientes a las subunidades α y β, respectivamente (Fig. 3A). Mientras que la APC purificada de C. officinalis reveló dos bandas de 15,0 KDa y 17,0 KDa correspondientes a las subunidades α y β, respectivamente (Fig. 3B).

Curva del perfil de elución de C-PC de A. platensis (A) y APC de C. officinalis (B) mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando tampón acetato en el rango de pH de 3,8 a 5,6.

Espectros de absorción de ficobiliproteínas en cada paso de purificación. (A) Espectro de absorción UV-visible de C-ficocianina de A. platensis durante los pasos de separación y purificación. (B) Espectro de absorción UV-visible de aloficocianina de C. officinalis durante los pasos de separación y purificación.

Análisis SDS-PAGE al 12% de las ficobiliproteínas purificadas durante los pasos de purificación. (A) Análisis SDS-PAGE de la ficocianina purificada de A. Platensis; el carril 1 es el marcador de peso molecular de la proteína, el carril 2 es la salida de la columna CM Sephadex, el carril 3 es la ficocianina eluida de la columna CM Sephadex y el carril 4 es la ficocianina purificada eluida de la columna CM Sephadex (B) Análisis SDS-PAGE de la aloficocianina C purificada officinalis El carril 1 es un marcador de peso molecular de proteína, el carril 2 es la salida de la columna CM Sephadex, el carril 3 es la aloficocianina eluida de la columna CM Sephadex y el carril 4 es la aloficocianina purificada eluida de la columna CM Sephadex.

El nivel de pureza de las PBP extraídas y purificadas fue diferente según la especie de alga y el grado de purificación. El índice de pureza de las PBP extraídas es una propiedad esencial para usos específicos (Tabla 1). Según Rito-Palomares et al.19, los preparados de ficocianina con un ratio A620/A280 igual o superior a 0,7 se consideran grado alimentario, aquellos con un ratio A620/A280 entre 0,7 y 3,9 son grado reactivo y aquellos con un ratio A620/A280 entre 0,7 y 3,9. Los A280 superiores a 4,0 son de grado analítico y de grado farmacéutico, son suficientes para satisfacer las necesidades de una aplicación específica. El nivel de pureza de todas las muestras fue recomendado para una aplicación específica, excepto el APC crudo (0,49%), lo que lo hace adecuado como fuente de aditivo para alimentos saludables20,21. Las proporciones A620/A280 demostradas previamente estudiadas de C-PC puro para A. platensis fueron 5,59, 6,69 y 4,9822.

La Figura 4 muestra el análisis FT-IR de la C-PC purificada de A. platensis (Fig. 4A) y la APC purificada de C. officinalis (Fig. 4B) y demuestra la banda de amida I específica de proteína a 1635/cm para C -PC y a 1631/cm (estiramiento C=O) y amida II a 1540/cm para C-PC y 1528/cm para APC. Nuestros resultados están de acuerdo con los estudios previos que mostraron que las proteínas amida I y amida II presentaban bandas de vibración a 1650/cm y 1645/cm, respectivamente23,24. La posición y forma de la banda de amida I se utilizan para estudiar la estructura secundaria de las proteínas. La banda nítida de amida I tanto para C-PC como para APC refleja la hélice a como el elemento común de su estructura conformacional secundaria. Además de esto, el análisis FTIR de las C-PC y APC purificadas confirmó aún más su pureza por la ausencia de fosfatos y sulfatos inorgánicos (que representan bandas intensas a 985/cm y 1061/cm).

Espectro FTIR de (A) ficocianina purificada de A. Platensis y (B) aloficocianina purificada de C. officinalis.

Las ficobiliproteínas están ganando popularidad debido a sus características estructurales y fisicoquímicas altamente conservadas y a su potencial como agentes antioxidantes, antiinflamatorios y propiedades inmunoestimulantes5.

La capacidad antioxidante de ambas especies de algas, la C-PC y la APC extraídas y sus fracciones, se evaluó in vitro utilizando tres técnicas, como se ilustra en la Fig. 5. Generalmente, la actividad antioxidante de los extractos metanólicos de las algas fue mayor que la de los extractos de C-PC y APC purificados y fraccionados en todos los ensayos probados. Esta variación puede deberse al hecho de que ambas especies probadas contienen diferentes compuestos bioactivos como polisacáridos, compuestos fenólicos y ácidos grasos21,25.

Actividad antioxidante de A. platensis C-PC y C. officinalis APC y sus fracciones mediante diferentes ensayos.

Existe una variación significativa en el porcentaje de eliminación del radical DPPH por C-PC y APC purificados y fraccionados de ambas especies de algas, lo que indica que las muestras analizadas eran donantes de electrones y podían reaccionar con los radicales libres y convertirlos en compuestos más estables para terminar. la interacción de la cadena radical. Las PBP son un eliminador natural de radicales libres, como lo revelan numerosos estudios26,27,28, dependiendo de vías tanto primarias como secundarias al quelar el ion metálico que genera ROS28. Además, la cantidad y ubicación de los aminoácidos afectan la capacidad de las PBP para actuar como antioxidantes11.

La fracción 1 (F1) exhibió una mayor actividad eliminadora que el crudo, las otras dos fracciones y el estándar (ácido ascórbico) en las especies analizadas. Los resultados mostraron que la F1 que se purificó mediante extractos de precipitación con sulfato de amonio podría tener algunos compuestos con mejor eliminación de DPPH y H2O2. Los valores de IC50 del extracto metanólico de A. platensis y C. officinalis (604,20 y 778,61 µg/mL), los extractos metanólicos crudos de C-PC y ACP (629,94 y 893,39 µg/mL) y el F1 (613,15 y 850,0 µg/mL) ) fueron inferiores a la CI50 del ácido ascórbico 974,39 µg/ml. Esto también se reflejó en los valores de CI50 evaluados, los cuales fueron diferencias altamente significativas con los registrados para el fármaco estándar (ácido ascórbico) (974,39 µg/mL).

Ambas especies de algas y sus muestras de ficobiliproteínas exhibieron capacidades antioxidantes totales comparables. Los datos detectados coincidieron con los de Sonani et al.27, quienes afirmaron la capacidad antioxidante de PC, PE y APC de la cianobacteria marina Lyngbya sp. A09DM contribuyó igualmente tanto a la actividad quelante como a la actividad reductora. Además, varias especies de cianobacterias generaron diversos extractos de ficobiliproteínas con diferente eficacia antioxidante29. Cherdkiatikul y Suwanwong11 detectaron que APC tenía una mayor actividad eliminadora de radicales peroxilo que C-PC, mientras que C-PC tenía una mayor actividad eliminadora de radicales hidroxilo que APC.

Recientemente, los medicamentos antiinflamatorios elaborados a partir de sustancias naturales de origen marino han recibido mucha atención12. Las enzimas lipoxigenasas catalizan la conversión del ácido araquidónico en ácidos hidroperoxi eicosatetraenoicos (HPETE), que luego se reducen a ácidos monohidroxieicosatetraenoicos (mono-HETE) o (diHETE) y leucotrienos; estos están clasificados como uno de los mediadores naturales más potentes de la hipersensibilidad y la inflamación30.

Como se muestra en la Tabla 2, los extractos metanólicos de algas y el crudo de C-PC y APC y sus fracciones de cada especie mostraron actividad antiinflamatoria. El porcentaje de actividad inhibidora contra la 15-lipoxigenasa por el extracto de metanol de algas y las PBP extraídas crudas fue mayor que el de las fracciones purificadas en comparación con el ácido ascórbico. La actividad antiinflamatoria selectiva de los pigmentos extraídos podría deberse a muchos factores, incluida la reducción de los niveles de lipopolisacáridos (LPS), la inhibición de la expresión de NF-κB, la supresión de la apoptosis, la reducción de la respuesta autoinmune, la inhibición de la actividad de la ciclooxigenasa (COX-2), actividad mieloperoxidasa, activando así los macrófagos31. Además, las propiedades depuradoras de las PBP hacia especies reactivas de oxígeno y sus efectos inhibidores sobre la actividad de la COX-2 pueden ser las causas de sus acciones antiinflamatorias32. En este contexto, Ferreira et al.33 demostraron el papel de la C-PC en la acción antiinflamatoria y antioxidante. Se ha demostrado que la C-PC, una sustancia aislada de A. platensis, tiene efectos antiinflamatorios y antioxidantes34. La variación en la actividad antiinflamatoria puede estar relacionada con el efecto del proceso de purificación sobre la naturaleza de las ficobiliproteínas, que son proteínas por naturaleza y se ven afectadas por una variedad de factores, como el proceso de extracción, la temperatura, los tipos químicos y la proporción29.

Además, los valores estimados de IC50 fueron 670,73, 668,33, 658,01, 675,56 y 799,74 µg/mL para C. officinalis, APC crudo, F1, F2 y F3, respectivamente, comparados con diclofenaco a 689,46 µg/mL. Mientras que los valores de CI50 evaluados para el extracto metanólico de A. platensis, C-PC, F1, F2 y F3 fueron 663.6, 671.2, 670.73, 699.78 y 737.25 µg/mL. Estos resultados indicaron que la actividad antiinflamatoria no sólo difiere según la especie de alga, sino también según la estructura de la ficocianina extraída y sus fracciones.

Con respecto a la actividad antidesnaturalización de las algas analizadas y sus fracciones de ficobiliproteínas extraídas (Tabla 2), la capacidad antidesnaturalización se utilizó para probar su capacidad para controlar la producción de autoantígenos y así inhibir la desnaturalización de proteínas en comparación con el diclofenaco. sodio como fármaco estándar, donde la principal causa de artritis reumatoide es la desnaturalización de proteínas y la producción de autoantígenos35. A diferencia del medicamento diclofenaco sódico, las muestras demostraron su potencial para limitar la síntesis de autoantígenos y, en consecuencia, inhibir la desnaturalización de proteínas, que es un factor clave que contribuye a la artritis reumatoide35. Era evidente que los extractos metanólicos de algas y C-PC y APC crudos de ambas especies analizadas tenían una mayor actividad antiartrítica que las fracciones. Los extractos metanólicos de C. officinalis y A. platensis contenían diferentes sustancias bioactivas que tenían actividad antidesnaturalización21,36.

Las CI50 evaluadas fueron en el siguiente orden extracto metanólico de C. officinalis (571,43 µg/mL), A. platensis (579,24 µg/mL), C-PC (638,98 µg/mL) y APC (649,52 µg/mL), los cuales se compararon significativamente con el valor de diclofenaco (699,3 µg/mL). Los efectos antiartríticos de las PBP pueden deberse a su capacidad para eliminar ROS, así como a su eficacia para bloquear el metabolismo del ácido araquidónico y la generación de citocinas como el factor de necrosis tumoral (TNF)37.

En este estudio, investigamos el efecto antimicrobiano de las algas analizadas y sus fracciones de PBP contra bacterias patógenas marinas mediante la medición de la turbidez en condiciones estériles de laboratorio. Se encontró que los extractos metanólicos de algas y las PBP crudas de ambas especies analizadas tenían una mayor actividad antibacteriana que las fracciones de PBP (Tabla 3). Mientras que los extractos metanólicos de C. officinalis y A. platensis contenían diferentes sustancias bioactivas que inhiben el crecimiento bacteriano en diferentes niveles dependiendo de la fuente del extracto, el disolvente de extracción y la concentración del pigmento en el extracto, así como del medio marino probado. patógenos como se demostró en estudios previos36,38. La actividad antimicrobiana de las PBP dependía de la naturaleza proteica de estos pigmentos y de las propiedades hidrofóbicas de su contenido de aminoácidos39. Los resultados mostraron que los extractos de algas metanólicas y las PBP crudas de las dos especies analizadas exhibieron una mayor actividad antibacteriana contra las bacterias marinas Gram +ve que las especies Gram −ve. La resistencia de las bacterias Gram-ve puede deberse a la estructura de su membrana externa, o a la presencia de genes de resistencia y ADN de otras cepas de resistencia, o cambios genéticos en el ADN que pueden cambiar la producción de proteínas y conducir a receptores que reconocen las bacterias Gram-ve. antibióticos40. En este contexto Gentscheva41 indicó que los extractos metanólicos, etanólicos y acuosos de A. platensis tienen actividad antimicrobiana contra cuatro tipos diferentes de bacterias Gram +ve, a saber, S. aureus, S. pneumonia, B. cereus, E. faecalis, no La actividad antimicrobiana del extracto metanólico da resultados positivos con S. pneumonia y B. cereus. Además, Kovaleski42 informó la actividad antimicrobiana de las PBP extraídas de algas rojas, y Safari4 registró la actividad inhibidora de C-PC de A. platensis en S. aureus.

Las ficobiliproteínas de las algas rojas y las cianobacterias son subproductos valiosos de pigmentos proteicos con una variedad de aplicaciones económicas. Recientemente, se ha vuelto más crucial reemplazar los colores sintéticos debido a sus efectos beneficiosos. Los resultados del presente estudio demuestran claramente que las C-PC y APC crudas y sus fracciones de A. platensis y C. officinalis exhibieron altas actividades biológicas in vitro, incluyendo actividad antioxidante, antiinflamatoria, antiartrítica y actividades antimicrobianas, con diferentes proporciones según la especie de alga y el grado de purificación. Estos hallazgos proporcionan datos de referencia del pigmento, que pueden utilizarse en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética. Los estudios futuros deberían dirigirse a mejorar la producción de PBP y también mejorar sus actividades biológicas.

Se aisló Arthrospira (Spirulina) platensis (Geitler) de Cyanophyceae del agua de mar de Eastern Harbor, Alejandría, Egipto, y luego se aisló y cultivó en el laboratorio en medio Zarrouk43. La identificación de la especie se realizó según Desikachary44 y el sitio web de Algae Base45. El cultivo de A. platensis se incubó a 30 °C en ciclos de 12:12/luz-oscuridad a una intensidad de luz de 40 μE/m2/s. Luego se recogió en la etapa estacionaria (después de 12 días) mediante centrifugación a 4500 x g durante 20 minutos y la biomasa obtenida se lavó minuciosamente con agua desionizada para eliminar las sales adheridas. Finalmente, el sedimento se liofilizó hasta un peso constante a 60 °C y luego se almacenó en un vial de vidrio en un refrigerador a -20 °C para su posterior análisis.

Corallina officinalis Linnaeus fresca de Rhodophyceae se recogió cuidadosamente durante la temporada de verano de 2021 en la costa rocosa distinta a lo largo del Puerto Oriental (longitudes 29,88°–29,90° E y latitudes 31,20°–31,22° N). La muestra recolectada se lavó con agua destilada y luego se limpió con un cepillo suave para eliminar epífitas y sustancias extrañas. El mismo día de la recolección, algunas de las algas recolectadas se conservaron en formalina (5%) en agua de mar para su identificación taxonómica según Aleem46, y luego se confirmaron con el sitio web de Algae Base45. Parte del talo limpio se secó hasta un peso constante a temperatura ambiente (27 ± 2 °C) sobre papel absorbente, luego se molió hasta obtener un polvo fino y se almacenó a -20 °C para usos posteriores.

Aproximadamente un gramo de cada biomasa seca se resuspendió en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,8, como tampón de trabajo (WB) y ambas biomasas suspendidas se rompieron mediante sonicación durante 60 s. Luego, la extracción de las ficobiliproteínas de A. platensis y C. officinalis se realizó en WB mediante congelación repetida a -20 °C y descongelación a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad una vez al día durante 4 días hasta que los extractos celulares adquirieron un color azul oscuro. Posteriormente, las mezclas de ficobiliproteínas de A. platensis y C. officinalis se centrifugaron a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C y se recogió el sobrenadante transparente. La absorbancia de cada extracción se midió a 562, 620 y 652 nm contra WB como referencia en blanco para calcular las concentraciones de C-ficocianina (C-PC), aloficocianina (APC) y ficoeritrina (PE)47,48. Para la purificación de las ficobiliproteínas de A. platensis y C. officinalis, el extracto crudo de cada biomasa se precipitó agregando lentamente sulfato de amonio al 65% mediante agitación continua para lograr una saturación del 65% con sulfato de amonio. Después de dejar reposar cada solución en una cámara fría durante 12 h, cada solución se centrifugó a 4500 x g durante 10 minutos y cada sedimento se resuspendió en un pequeño volumen de WB y se dializó durante 3 días frente a diez veces el volumen de WB49. Las soluciones dializadas obtenidas se aplicaron por separado a una columna de DEAE-celulosa preequilibrada con WB y se eluyeron con tampón acetato con un pH que oscilaba entre 3,8 y 5,6 para desarrollar la columna a un caudal de 20 ml/h49. Todas las fracciones que contenían ficobiliproteínas se recogieron y concentraron mediante ultrafiltración con un corte de 3 KDa (Millipore, Merk, EE. UU.) y se aplicaron a una columna Sephadex G100 equilibrada con WB. Las ficobiliproteínas de cada A. platensis y C. officinalis se eluyeron de una columna Sephadex G100 a un caudal de 0,5 ml/min usando WB que contenía NaCl 0,15 M. Tanto las algas rojas purificadas como las ficobiliproteínas de cianobacterias se caracterizaron durante cada paso de purificación y se analizaron mediante espectroscopia de absorción mediante el escaneo de las fracciones en un rango de 260 a 750 nm. La pureza de cada ficobiliproteína de A. platensis y C. officinalis se calculó en cada paso de purificación de acuerdo con las relaciones de absorbancia de A620/A280 y A650/A280 para C-PC y APC, respectivamente50. La pureza y homogeneidad de cada alga C-PC y APC se analizaron mediante SDS-PAGE al 12% con escalera de proteínas de rango medio (15–240 Mw). Todas las fracciones que contienen C-PC o APC purificadas se combinaron, dializaron, liofilizaron y mantuvieron a -20 °C hasta su uso posterior. Además, la C-PC y APC purificadas se caracterizaron mediante FTIR (Shimadzu FT-IR-8400 S, Japón).

La actividad antioxidante de las algas seleccionadas y las ficobiliproteínas extraídas (1000 µg/mL) se determinó en extractos metanólicos utilizando tres métodos estándar.

La capacidad de las algas probadas y sus extractos de ficocianina para eliminar los radicales libres DPPH se estimó según la técnica de Tierney et al.51. La actividad eliminadora de DPPH que fue eliminada se calculó usando la siguiente fórmula:

donde AC es la absorbancia del control y AS es la absorbancia en presencia de la muestra o estándar.

Las concentraciones de inhibición del 50% (CI50) de los radicales DPPH se calcularon mediante el software GraphPad Prism 6.

El TAC de las diferentes muestras se analizó mediante espectrofotometría a 695 nm. Sin embargo, el TAC detectado fue equivalente al estándar de ácido ascórbico (0,5 g/100 ml de agua destilada) y se expresó como mg/g de equivalente de ácido ascórbico (equivalente de AsA) según el método de Prieto et al.52.

La actividad eliminadora de H2O2 de las muestras analizadas o del ácido ascórbico como control se determinó a 230 nm según Gülçin et al.53.

El porcentaje de actividad eliminadora de H2O2 se estimó mediante la fórmula:

Los valores de CI50 también se calcularon como se describió anteriormente.

El ensayo de actividad anti-lipoxigenasa de los extractos metanólicos de la muestra se basó en medir la formación del complejo Fe3+/naranja de xilenol utilizando un espectrofotómetro a 560 nm54. La relación de inhibición se calculó utilizando la siguiente ecuación utilizando quercetina "fármaco estándar" como fármaco estándar.

donde A control es la absorbancia del control, A blanco es la absorbancia del blanco y A muestra es la absorbancia de la muestra.

La capacidad antidesnaturalización de las muestras analizadas se determinó mediante el método de Sakat et al.55 con ligeras modificaciones. Se utilizaron diclofenaco sódico “fármaco comercial” y agua destilada como controles positivos y negativos, respectivamente. El porcentaje de inhibición se midió a 660 nm y se estimó usando la siguiente fórmula.

donde A control es la absorbancia del control, A blanco es la absorbancia del blanco y A muestra es la absorbancia de la muestra.

Las cepas bacterianas patógenas gramnegativas analizadas “Escherichia coli ATCC8739, Vibrio fluvialis ATCC33809, V. fluvialis ATCC33809, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, P. fluorescencia ATCC13525, Klebsiella pneumonia ATCC13883 y Aeromonas hydrophila ATCC13037”, y los grampositivos Bacillus sutlils ATCC 6633, Enterococcus faecalis ATCC29212, Streptococcus agalactiae ATCC13813 y Staphylococcus aureus ATCC25923 se obtuvieron del Laboratorio de Microbiología Marina, NIOF, Alejandría.

Utilizando técnicas asépticas, se transfirió una única colonia bacteriana a un caldo nutritivo de 100 ml y se colocó en una incubadora durante la noche a una temperatura de 37 °C. Después de 24 h de incubación, el caldo de cultivo bacteriano se centrifugó a 6000 rpm durante 15 minutos y luego se preparó un sedimento limpio de bacterias. El caldo se centrifugó utilizando precauciones asépticas adecuadas. El sobrenadante resultante se descartó en un vaso de precipitados de desecho etiquetado. El sedimento resultante se resuspendió en 20 ml de solución salina estéril y se centrifugó nuevamente a 6000 rpm durante 15 minutos. Este paso se repitió muchas veces hasta que el sobrenadante obtenido quedó claro. Luego, el sedimento se suspendió en 20 ml de solución salina estéril y se etiquetó como Bs (suspensión en caldo). La densidad óptica de Bs se registró en un rango de onda de 600 nm y se llevaron a cabo diluciones en serie con métodos asépticos adecuados hasta que la densidad óptica de Bs alcanzó el rango de 0,5 a 1,0. El número real de unidades formadoras de colonias (UFC) se calculó y estimó a partir del gráfico de viabilidad. Se estimó el factor de dilución necesario y se realizó la dilución seriada hasta alcanzar una concentración de 5 × 106 ufc/mL56.

Se prepararon tubos de ensayo etiquetados en condiciones asépticas. 10 μL del extracto de algas de prueba disueltos en 1000 μg/mL (p/v) de DMSO (generalmente una concentración madre de 1 mg/mL para compuestos purificados), antibiótico (como control positivo) y caldo nutritivo únicamente (como control negativo). control) se pipetearon en 900 μL de caldo nutritivo que contenía tubos de ensayo. Finalmente, se agregaron 10 μL de suspensión bacteriana a cada tubo de ensayo para alcanzar una concentración de 5 × 106 ufc/mL. Luego, los tubos de ensayo obtenidos se envolvieron sin apretar con film transparente. Cada gradilla tenía tubos de ensayo con un conjunto de controles, un antibiótico de amplio espectro como control positivo (generalmente ciprofloxacina en la misma concentración que el compuesto de prueba para las bacterias y diclofán para las levaduras), todas las soluciones con excepción del compuesto de prueba, y todas las soluciones con excepción de la solución bacteriana agregaron 10 μL de caldo nutritivo56.

Según el método de estándares de Macfarland, normalmente una turbidez de 0,5 no es capaz de dar un número estándar de UFC para todas las cepas bacterianas, por lo que es muy difícil comparar entre diferentes especies bacterianas debido a las diferencias de densidad óptica. Entonces, para obtener un número bacteriano uniforme de diferentes especies, se debe preparar un conjunto de gráficos de muerte/viabilidad para cada especie bacteriana. Una concentración final alcanza 5 × 106 ufc/Ml. De este modo, se podrían comparar diferentes especies bacterianas y diferentes cepas57.

Los resultados obtenidos se expresaron como desviación estándar media ± (n = 3) y la significación estadística de las diferencias entre los diferentes tratamientos se estimó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el programa estadístico SPSS 15.0. Las diferencias se aceptaron y se consideraron significativas con un valor de P <0,05.

Todos los datos producidos durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Los autores están extremadamente agradecidos al Instituto Nacional de Oceanografía y Pesca (NIOF), Alejandría, Egipto, por proporcionar todas las instalaciones necesarias para completar este trabajo.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB).

Instituto Nacional de Oceanografía y Pesca, NIOF, El Cairo, Egipto

Mona M. Ismail y Ghada E. Hegazy

Departamento de Investigación de Proteínas, Instituto de Investigación en Ingeniería Genética y Biotecnología (GEBRI), Ciudad de Investigación Científica y Aplicaciones Tecnológicas, Alejandría, Egipto

Esmail M. El Fakharany

Departamento de Desarrollo de Bioprocesos, Instituto de Investigación en Ingeniería Genética y Biotecnología (GEBRI), Ciudad de Investigación Científica y Aplicaciones Tecnológicas, Alejandría, Egipto

Ghada E. Hegazy

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MMI, EME & GEH: conceptualización, metodología, validación, redacción-borrador original, redacción-revisión y edición.

Correspondencia a Mona M. Ismail o Ghada E. Hegazy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Ismail, MM, El-Fakharany, EM & Hegazy, GE Purificación y fraccionamiento de ficobiliproteínas de Arthrospira platensis y Corallina officinalis con evaluación de sus actividades biológicas. Informe científico 13, 14270 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41001-y

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Recibido: 10 de febrero de 2023

Aceptado: 20 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41001-y

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